白皮杉醇（ＰＣＴ）是一种自然多酚化合物，无数存在于葡萄、蓝莓及大黄等多栽植物中。 当今辩论已讲明，ＰＣＴ具备多种生物活性，包括解放基废除、抗菌、扼制白血病及抗癌等特质 。 此外，ＰＣＴ具有较小的毒反作用开yun体育网，对东谈主体的潜在不良影响较低 。当今研究ＰＣＴ在炎症调养中的文件较少，况且辩论局限于细胞推行阶段。 因此，需进一步辩论来笃定ＰＣＴ在动物模子中的炎症保护限度。

方法生物斑马鱼成为评价炎症反应及药筛的新兴动物模子。 斑马鱼（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）是鲤形目鲤科丹尼亚属的一种热带鱼，成年鱼个体较小、容易饲养、生息力强、胚胎透明 。 由于其助长发育周期比啮齿动物短，裁汰了进行动物推行需要的时刻和本钱 。 况且斑马鱼基因组与东谈主类基因有 ８７％ 的同源性 ，斑马鱼与东谈主体在药理药效上也有保守性。 此外，斑马鱼具有与哺乳动物相似的炎症反应机制 ，包括细胞因子的产生、炎症细胞的招募和炎症基因的抒发。 由于以上优点，斑马鱼成为合适评价炎症药物的新兴方法生物 ，且比年来，斑马鱼已被鲁莽用于药物的炎症缓解筛选以及相干安全性评价 。

本辩论诳骗方法动物斑马鱼的炎症模子，评价 ＰＣＴ 的抗炎限度，为后期开辟毒反作用小、本钱低的小分子药物提供依据。

推行方法

ＰＣＴ 安全浓度的摸索： 最初需要对斑马鱼进行安全浓度摸索，通过前期瞎想确立如下 ７ 个组别： Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＰＣＴ １ μｍｏｌ ／ Ｌ、ＰＣＴ ３ μｍｏｌ ／ Ｌ、ＰＣＴ １０ μｍｏｌ ／ Ｌ、 ＰＣＴ ３０ μｍｏｌ ／ Ｌ、ＰＣＴ ６０ μｍｏｌ ／ Ｌ、ＰＣＴ １２０ μｍｏｌ ／ Ｌ。 首 先对 ２４ ｈｐｆ 斑马鱼进行网络，对此时刻段的斑马鱼进行如上述浓度给药，为期 ３ 天。 ３ 天后对上述惩办斑马鱼进行明场拍照、荧光拍照，初步分析在不同 ＰＣＴ 浓度 下的斑马鱼表型是否额外，腹黑是否出现额外。

斑马鱼心率的统计与计较： 斑马鱼心率统计： 通过计较 １２ ｓ 内斑马鱼心跳次数，在此数量上乘５，即可取得斑马鱼每分钟心跳次数。

中性粒细胞召募推行： 铜是一种微量元素。 环境中过量的无机铜会轻视斑马鱼体内的铜均衡，导 致氧 化 应 激 损 伤 介 导 的 炎 症 反 应 。 在 硫 酸 铜 （ＣｕＳＯ４ ）给药后，体内的中性粒细胞被激活，连合到发 生炎症的脊椎神经丘部位，可通过此部位的中性粒细 胞连合历程，反馈炎症症状的轻重历程 。

推行准备 ３ ｄｐｆ Ｔｇ（ｃｏｒｏ１ａ：ＧＦＰ；ｌｙｚ：Ｄｓｒｅｄ） 荧光斑 马鱼，并对其余 ７ 个组进行 ２０ μｍｏｌ ／ Ｌ ＣｕＳＯ４ ，ＰＣＴ １ μｍｏｌ ／ Ｌ、ＰＣＴ ３ μｍｏｌ ／ Ｌ、ＰＣＴ １０ μｍｏｌ ／ Ｌ、ＰＣＴ ３０ μｍｏｌ ／ Ｌ、 ＰＣＴ ６０ μｍｏｌ ／ Ｌ、ＰＣＴ １２０ μｍｏｌ ／ Ｌ 惩办 ２ ｈ。 ２ ｈ 后，将 上述药液换成 ２０ μｍｏｌ ／ Ｌ ＣｕＳＯ４ ，再进行 ３０ ｍｉｎ 泄露， 后续使用显微镜对斑马鱼脊椎神经丘部位进行荧光拍 照，使用 ＩｍａｇｅＪ 对此部位荧结拜红色的中性粒细胞进行网络。

ｑＰＣＲ 考据炎症相干基因的抒发： 斑马鱼总 ＲＮＡ 索要：对 ３ ｄｐｆ 的 ＷＴ 斑马鱼进行如下给药惩办 １ ｈ：ＰＣＴ ３ μｍｏｌ ／ Ｌ、ＰＣＴ １０ μｍｏｌ ／ Ｌ、ＰＣＴ ３０ μｍｏｌ ／ Ｌ。 后 续对上述浓度斑马鱼及 Ｃｏｎｔｒｏｌ 组斑马鱼（另外留一组 Ｃｏｎｔｒｏｌ 组不进行任何泡药惩办）进行 ２０ μｍｏｌ ／ Ｌ ＣｕＳＯ４ 炎症 造 模 ２４ ｈ。 次 日 将 以 上 胚 胎 转 移 至 ２ ｍＬ ＲＮａｓｅＦｒｅｅ 离心管中，每管２０ 条，每组３ 个生物学访佛， 每管加入 ３００ μＬ ＲＮＡ 裂解液及数颗小磁珠，放至匀浆 仪上悠扬裂解胚胎。 尔后按照 ＥａｓｔｅｐＳｕｐｅｒ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ 要领对胚胎裂解物进行总 ＲＮＡ 索要，使用

Ｎａｎｏｄｒｏｐ 测浓度，临了将样品的 ＲＮＡ 保存在 － ８０℃ 。

回转录 ｃＤＮＡ：使用 ＴａＫａＲａ 公司的回转录试剂盒 将索要的 ＲＮＡ 回转录为 ｃＤＮＡ。

ｑＰＣＲ 推行：使用了 ＮＣＢＩ Ｐｒｉｍｅｒ Ｂｌａｓｔ 引物瞎想网 站瞎想的荧光定量 ＰＣＲ 引物，其长度在 １００ ～ ２００ ｂｐ。 每个反应均确立 ３ 个技艺访佛，并以回转录的 ｃＤＮＡ 为 模板稀释后进行扩增。 β⁃ａｃｔｉｎ 用于要领化参照，以矫正样本之间的互异。

收受 ２ － ΔΔＣｔ 进行数据网络。 所稀有据均经 Ｔｕｋｅｙ 独身分方差分析（ ｏｎｅ⁃ｗａｙ ＡＮＯＶＡ） 及 Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ 测验， 统计学权贵性互异界说为 Ｐ ＜ ０． ０５。 使用 ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ 软件制图（表 1 为 ｑＰＣＲ 引物序列）。

表 1 ｑＰＣＲ 的引物序列

本辩论最初开展 ＰＣＴ 安全使用浓度的摸索推行，为后续炎症推行奠定基础。 咱们对出死后 ２４ ｈ 的斑马鱼胚胎进行 ＰＣＴ 泡药 ３ 天的惩办，确立浓度进行显微镜明场拍照及荧光拍照，每 组 ３０ 个胚胎，确立 ３ 个生物访佛。 泡药鱼系为心室红 色荧光、心房绿色荧光特异性符号的鱼系 Ｔｇ （ ｖｍｈｃ： ｍＣｈｅｒｒｙ⁃ＮＴＲ； ａｍｈｃ：ＥＧＦＰ），明场下，可见斑马鱼腹黑发育无互异，并无心包腔水肿等额出门现，在荧结拜微 镜下进行不雅察，腹黑与 Ｃｏｎｔｒｏｌ 组比较，环化浮浅，泵跳有劲，无任何不良表型（图 Ａ）。 当 ＰＣＴ 浓度梯度从 １ μｍｏｌ ／ Ｌ 晋升至 １２０ μｍｏｌ ／ Ｌ 时，与对照组比较，斑马鱼 心跳次数无权贵互异，均在浮浅数值鸿沟内（图 Ｄ）。

随后，咱们对斑马鱼进行举止学推行，举止学测试 在斑马鱼进行药物泄露惩办的第 ６ 天进行，此时鱼较为活跃。 举止轨迹和相应的热图如图 Ｂ、Ｃ 所示。 确立浓度进行梯度浓度推行，每个浓度进行６次生物学访佛。 后续网络斑马鱼游动距离，并进行互异性分析（图 Ｅ）。 限度标明，在所确立梯度鸿沟内，与 Ｃｏｎｔｒｏｌ 组比较，该浓度梯度组不会对斑马鱼举止形成影响。 据此可得出论断，在ＰＣＴ １ μｍｏｌ ／ Ｌ、 ＰＣＴ ３ μｍｏｌ ／ Ｌ、 ＰＣＴ １０ μｍｏｌ ／ Ｌ、 ＰＣＴ ３０ μｍｏｌ ／ Ｌ、 ＰＣＴ ６０ μｍｏｌ ／ Ｌ及 ＰＣＴ １２０ μｍｏｌ ／ Ｌ 鸿沟内，ＰＣＴ 不会对斑 马鱼形成任何影响，故可在该浓度鸿沟内进行后续推行。

白细胞介素⁃６（ＩＬ⁃６）是一种多功能细胞因子，由多种细胞（包括淋巴细胞、单核巨噬细胞等）产生，鲁莽参与免疫和炎症反应的编削 ，在炎症发生时，ＩＬ⁃６ 水平会高涨。 环氧合酶２（ＣＯＸ⁃２）是一种勾通酶，在细胞受到炎症刺激时抒发量增多，血液中肿瘤坏死因子⁃α（ＴＮＦ⁃α） 基因抒发水平的升高相似标明炎症反应的存在。 在 ＣｕＳＯ４ 刺激后，斑马鱼体内 ＩＬ⁃６、ＣＯＸ⁃２ 及ＴＮＦ⁃α 抒发水平权贵上调，其中 ＩＬ⁃６ 基因的抒发量高涨 ２ 倍， ＣＯＸ⁃２ 及 ＴＮＦ⁃α 的抒发量高涨较高，比较于对照组而言，抒发量均高涨 ７ 倍。 与 ＣｕＳＯ４ 单独惩办组比较， ＰＣＴ 惩办 ２４ ｈ 后，ＩＬ⁃６、ＣＯＸ⁃２ 及 ＴＮＦ⁃α 的抒发水平下 调（图1）。

图 1 ＣｕＳＯ４刺激及 ＰＣＴ 惩办后斑马鱼幼体炎症相干基因 ｑＰＣＲ 推行

本辩论发现 ＰＣＴ 对斑马鱼炎症具有缓解作用，在斑马鱼生息液中加入化合物 ＣｕＳＯ４ 可确立细胞毁伤及 氧化应激的斑马鱼炎症模子，在该炎症模子中，中性粒细胞在脊椎神经丘中的积贮是最常用的炎症水平策划之一，该策划已被鲁莽用于评估抗炎药物限度 。 ＲＯＳ 不错径直激活细胞内的炎症信号通路，如核因子⁃ κＢ （ ＮＦ⁃κＢ ） 和 促 分 裂 原 活 化 的 蛋 白 质 激 酶 （ＭＡＰＫ） ，这些信号通路的激活导致炎症细胞因子的抒发增多，从而促进炎症反应，这阐述为 ＲＯＳ 水平高涨和中性粒细胞向脊椎神经丘的趋化。

有文件报谈 ＰＣＴ 不错促进抗氧化核转录因子红系２相干因子 ２ （Ｎｒｆ２）的核易位和靶基因转录，从而指责细胞内 ＲＯＳ 水平 。 ＰＣＴ 可通过扼制 ＮＦ⁃κＢ 通路阐述抗炎作用 ，且扼制 ｐ６５ 的核易位及促炎细胞因 子分泌，包括 ＩＬ⁃６、ＴＮＦ⁃α 和 ＩＬ⁃８ 。

论断：

咱们的辩论限度强化了ＰＣＴ 通过抗氧化阶梯缩小 炎症毁伤的表面。 相当是 ＰＣＴ 对 ＲＯＳ 水平的指责作用，这少量在扼制炎症细胞因子抒发的推行中取得了确认。 这些发现不仅撑捏 ＰＣＴ 行为潜在抗炎调养药物的远景，也为浩大炎症性疾病的分子机制提供了新视角。 将来的辩论不错聚会在以下几个标的：可进一步长远辩论 ＰＣＴ 在体内的继承、散播、代谢特质，以优化其行为药物的剂量和给药频率。 此外可通过评估 ＰＣＴ 永恒应用的安全性，确保其行为调养药物的可行性，以 及辩论 ＰＣＴ 与其他抗炎药物的协同效应，探索和谐治 疗的可能性。 要而论之，ＰＣＴ 可扼制炎症反应，为 ＰＣＴ 行为潜在抗炎调养药物提供了有劲笔据。

参考文件：

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